Муковисцидоз (MB) - наиболее распространенное тяжелое, аутосомно-рецессивное заболевание. Ген, ответственный за развитие заболевания, был картирован в 1989 г., а продукт его (белок) назван "муковисцидозный трансмембранный регулятор проводимости муковисцидоза" (Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator - CFTR} [l]. К настоящему времени обнаружены около 900 мутаций в гене CFTR, приводящих к развитию заболевания. По данным Международного консорциума, менее 10 мутаций в гене CFTR можно считать часто встречающимися в мире [2]. Относительной частоты эти мутации в объединенной выборке МБ хромосом достигают следующих значений: DF508 - 66 %, G542X - 2,2%, G551D - 1,6%, N1303K - 1,3%, W1282X - 1,2%, R553X - 0,7%, 621 + 1G-T - 0,7%, 1717-1G-A - 0,6%. Остальные являются распространенными лишь в некоторых популяциях, а многие уникальны, т.е. встречаются только в одной семье. Спектр и относительные частоты MB мутаций существенной различаются в разных популяциях.

Молекулярно-генетическое обследование больных MB проводится в МННЦ РАМН начиная с 1990 г. Первоначальной задачей было определение спектра MB мутаций, характерных для российских больных. Совместно с Институтом биогенетики (Брест, Франция) обследованы выборки 38 больных MB из Центральной России, изучались все 27 экзонов и области экзонинтронных соединений гена CFTR методом денатурирующего гель-электрофореза с последующим секвенированием фрагментов ДНК с аномальной подвижностью [3]. В результате работы были выявлены 18 различных мутаций в гене CFTR, 3 из них описаны впервые - 175DС, 624DТ и D572N, и определены мутации, которые могли считаться распространенными среди больных из России. К таким мутациям можно было отнести F508D (10-й экзон), W1282X (20-й экзон), 2143DТ (13-й экзон), 2184insA (13-й экзон) и 3821DТ (19-й экзон). Более 25% МВ-аллелей остались неидентифицированными в исследованной выборке больных даже после изучения всей кодирующей последовательности гена CFTR. Это отличает популяцию России от большинства популяций Западной Европы, где более 95% мутантных аллелей гена CFTR обусловлено изменениями последовательности нуклеотидов в экзонах или местах сплайсинга.

Хотя более 95% мутаций в гене CFTR обусловлены заменой одного нуклеотида на другой, предполагается, что в популяциях, где не удается выявить полный спектр мутаций в кодирующей части гена, вероятно обнаружить протяженные делеции. В литературе опубликованы данные о 5 таких делениях, но оказалось, что они являются либо очень редкими мутациями, либо встречаются только в конкретных популяциях [4-8].

Недавно была обнаружена еще одна протяженная делеция, охватывающая экзоны 2 и 3 гена CFTR [9]. Несколько предварительных наблюдений доказывали возможность существования такой делеции. У некоторых больных MB невозможно было амплифициро-вать 2-й и 3-й экзоны, используя стандартные методы. В последствии было показано, что эти больные являлись гомозиготами по данной делеции.

У 3 больных из Германии, Канады и Испании, являющихся гетерозиготными компаундами по мутации предполагаемой делеции и G551D, R347P и DF508 соответственно, в половине мРНК транскриптов CFTR-тена было обнаружено комбинированное отсутствие 2-го и 3-го экзонов. Гель-электрофорез в пульсирующем поле (PFGE) с последующей блот-гибридизацией по Саузерну выявил аберрантные полосы в образцах некоторых больных MB с неизвестными мутациями, согласующихся с наличием геномной делеции размером 20-25 тыс.п.н. После определения точек разрыва оказалось, что делеция охватывает 21,08 тыс.п.н. и включает около 25% интрона 1, полностью экзон 2, интрон 2 и экзон 3 и примерно 45% интрона 3. Последовательности нуклеотидов в точках разрыва делеции негомологичны, за исключением короткого участка длиной 4 пиримидина (5'-СТТТ-3'), идентичного в обеих точках разрыва. На уровне кДНК в результате данной делеции происходит сдвиг рамки считывания и образования терминирующего сигнала в 106-м кодоне в экзоне 4. В дальнейшем при использовании дуплексной ПЦР-амплификации была проведена обширная работа по определению встречаемости делеции, обозначенной как CFTRdele2,3(21kb), в разных популяциях. В этой работе участвовали лаборатории из большинства европейских стран, а также лаборатории из Канады, США и Уругвая. Было показано, что данная мутация распространена у больных из Чехии, России, Белоруссии, Австрии, Германии, Польши, Украины, Словении и Словакии (6,4, 4,1-5,8, 3,3, 2,6, 0,5-2,5, 1,0-1,8, 1,2, 1,5 и 1,1 соответственно). Мутация CFTRdele2,3 (21kb) является второй частой мутацией после DF508 у больных MB Центральной и Восточной Европы. Эта мутация спорадически встречается у больных Западной Европы и совершенно отсутствует у больных из Болгарии, Хорватии, Румынии и Сербии. Предполагается, что мутация имеет славянский источник происхождения, ее географическое распространение в Европе соответствует распространению славян в первом тысячелетии нашей эры.

В лаборатории генетической эпидемиологии выработана определенная стратегия молекулярно-генети-ческой диагностики MB в семьях, имеющих больного ребенка. В результате двух мультиплексных ПЦР-ре-акций проводится анализ мутаций, суммарно составляющих около 65 МВ-аллелей встречающихся у больных из России. В дальнейшем проводится поиск некоторых менее распространенных мутаций. Анализ мутаций проводится методом анализа длин амштифицированных фрагментов ДНК, гетеродуплескных полос, образующихся при амплификации гетерозиготных образцов и рестрикционного анализа. В лаборатории проводится рутинный поиск 20 мутаций в гене CFTR как характерных для больных из России, так и часто встречающихся в мировой выборке больных MB.

К настоящему моменту молекулярно-генетический анализ выполнен для 466 пациентов и их родителей. Предварительное клиническое обследование и постановка диагноза проводили в научно-клиническом отделении муковисцидоза МНГЦ РАМН и некоторых медико-генетических консультациях региональных центров. Более 80% обследованных пациентов проживали в европейской части России, около 15% из районов Сибири и Дальнего Востока и менее 5% из сопредельных государств. В исследованной выборке обнаружены 13 частных мутаций в гене CFTR, их относительная частота приведена в табл., а суммарная доля составляет около 75%. Мутации I507a, R347P, R553X, 621 + 1G-T, E85Q, R1162X и 1717-1G-A в нашей выборке не обнаружены.

Таблица. Относительная частота CFTR-мутацией у больных MB из России

Примечание: * - количество исследованных МБ не-DF508-хромосом

Наиболее распространенной, как и в большинстве европейских популяциях, является мутация F508D. Значение доли этой мутации среди всех MB мутаций для России мало отличается от значений, полученных для стран Восточной Европы, где проживают в основном этнические группы, имеющие славянское происхождение. И следовательно, можно предполагать, что для всех славянских народов характерна более низкая доля мутации DF508, чем для народов Северо-Западной Европы. Второй по распространенности в исследуемой выборке была мутация CFTRdele2,3 (21kb). Ее относительная частота превысила значение, полученное в предварительном исследовании [3]. Считается, что эта мутация имеет славянское происхождение, но нами она была обнаружена и у больных других национальностей. Две мутации в 13-м экзоне гена CFTR, 2143DT и 2184insA являются относительно частыми в исследованной выборке, их суммарная доля составляет около 3,3-4%. Недавно обнаружено, что эти мутации достаточно часты среди больных Чехии и Польши, что позволяет предположить их славянское происхождение. Кажется вероятным, что возможно выделить ядро частых "славянских" MB мутаций, но их происхождение и история распространения требуют дальнейшего исследования и уточнения.

Суммарная доля идентифицированных мутаций в исследованной нами выборке больных MB из России составляет около 75% от общего количества MB хромосом, т.е. примерно у 55% больных удается определить обе мутации в гене CFTR, у 38,5% больных идентифицирована одна мутация, а у 6,5% обе мутации не идентифицированы. Поэтому в семьях, где один или оба родителя являются носителями неидентифицированных мутаций в гене CFTR, проводится анализ внутригенных и внегенных полиморфных ДНК-маркеров для определения фазы сцепления мутантного аллеля гена CFTR. Для косвенного тестирования мы используем 4 внутригенных (динуклеотидных CA/GT повторы в 1, 8, 17В-интронах и тетрануклеотидные GATT повторы в 6А-интроне гена CFTR: IVS1CA, IVS8CA, IVS17BCA, INS6aGATT соответственно) и 4 внегенных (XV2c, KM19, CS7 и J3.11) полиморфизма. Более предпочтительным в качестве маркеров является использование внутригенных полиморфизмов, так как в этом случае вероятность кроссинговера между полиморфным сайтом и сайтом мутации практически исключена. Наиболее информативным в исследованной выборке MB семей оказался полиморфизм INS1CA, около 62,5% семей полностью информативны по этому маркеру. При совместном использовании всех маркеров информативность теста достигает 100% практически во всех семьях, имеющих больного MB ребенка. В МГНЦ РАМН проведены 53 пренатальных диагностики MB в семьях высокого риска в первом триместре беременности. 33 диагностики проведены методом прямой идентификации родительских MB мутаций у плода (ДНК ворсин хориона), в 16 случаях выявляли известную мутацию одного родителя и использовали информативные ДНК-маркеры для определения мутантной хромосомы другого родителя, 4 диагностики проведены косвенным методом с использованием маркерных систем. В 13 случаях плод унаследовал только нормальные хромосомы родителей, в 27 являлся здоровым носителем одной мутации и в 13 случаях плод был поражен.

Литература

1. Rinrdan J.R., Rnmmens J.M., Кс.гс.т B.Sh. fit al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science 1989; 245: 1066-1073.
2. The Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium. Population variation of common cystic fibrosis mutations. Hum. Mutat. 1994; 4: 167-177.
3. Verlinguer C., Kapranov N.I., Mercier B. et al. Complete screening of mutations in the coding sequence of the CFTR gene in a sample of CF patients from Russia: Identification of three novel allels. Hum. Mutat. 1995; 113: 205-209.
4. Morral N., Nunes V., Casals T. et al. Uniparenteral inheritance of microsatellite allerts of the cystic fibrosis gene (CFTR): identification of a 50 kilobase deletion. Hum. Mol. Genet. 1993; 2: 677-681.
5. Magnani C., Cremonesi L., Giunta A. et al. Short direct repeats at the breakpoints of a novel large deletion in the CFTR gene suggest a likely slipped mispairing mechanism. Hum. Genet. 1996; 98: 102-108.
6. Cheualier-Porst F., Bonardot A.M., Chazalette J.P. et al. 40 Kilo-base deletion (CF44dele4-10) removes exons 4-10 of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene. Hum. Mutat. 1998; suppl.l: 291-294.
7. Mickle I.E., Macek MJr., Fulmer-Smentek S. et al. A mutation in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene associated with elevated sweat chloride concentrations in the absence of cystic fibrosis. Hum. Mol. Genet. 1998; 7:729-735.
8. Lerer I., Laufer-Cahana A., Rivlin J.R. et al. A large deletion mutation in the CFTR gene (3120+lkbdel8, 6kb): a founder mutation in the Palestinian Arabs. Hum. Mutat. 1999; 13: 337.
9. Dork Т., Macek MJr., Abekas F. et al. Characterization of a novel 21-kb deletion, CFTRdele2,3(21kb), in the CFTR gene: a cystic fibrosis mutation of Slavic origin common in Central and East Europe. Hum. Genet. 2000; 106: 259-268.