Материал и методы

Обследованы образцы мокроты у 31 ребенка в возрасте от 1 до 13 лет (средний возраст — 7,6 ± 0,5 лет) с тяжелым и среднетяжелым течением заболевания. Диагноз был установлен на основании клинико-анамнестических и лабораторных данных и подтвержден генетическими исследованиями. Исследование образцов мокроты больных проводилось в динамике развития заболевания — в фазе обострения и минимальной активности воспалительного процесса. Мокроту собирали в стерильные флаконы, измеряли ее объем и разводили 0,9%.ным физиологическим раствором в соотношении 1 : 3, гомогенизировали, затем центрифугировали 30 мин при 20 000 g.

Уровни цитокинов определяли в мокроте с помощью "сэндвич-метода" — твердофазного иммуно-ферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем ООО "Цитокин" (Санкт-Петербург). Активность эластазы в мокроте определяли спектрофотометрическим методом c использованием синтетического субстрата паранитрофенилового эфира N-бутил-L-аланил-L-аланил-L-аланина в ацетонитриле (BANPE, "Sigma"). Уровень α1-ингибитора протеиназ (α1-PI) в мокроте определяли методом ракетного иммуноэлектрофореза. Уровни миелопероксидазы (MPO) и лактоферрина (LF) определяли с помощью "сэндвич-метода" с использованием кроличьих антител против миелопероксидазы и лактоферрина человека (ГУИЭМ РАМН).

Результаты

При исследовании уровня провоспалительных цитокинов в мокроте больных с тяжелым и среднетяжелым течением заболевания было выявлено достоверное повышение величины исследуемых показателей (p < 0,05) при обострении заболевания по сравнению с минимальной активностью воспалительного процесса. По мере нарастания тяжести воспаления, в фазу обострения, отмечалось достоверное (p < 0,01) возрастание уровней исследуемых провоспалительных цитокинов в мокроте больных (табл. 1).

Таблица 1. Уровни провоспалительных цитокинов в мокроте больных МВ (М ± m).

Полученные данные указывают на важную диагностическую роль уровней интерлейкинов (IL-1β и IL-8) и фактора некроза опухоли-α (TNF-α) в мокроте больных МВ для характеристики фазы заболевания и тяжести течения воспалительного процесса в бронхолегочной системе больных.

О типе поляризации иммунного ответа можно судить по соотношению цитокинов в различных биологических жидкостях. Из целого спектра таких цитокинов в данном исследовании в мокроте больных МВ определяли уровни интерферона-γ (INF-γ) и интерлейкина-4 (IL-4). Выявлено достоверное (p < 0,05) повышение содержания этих цитокинов в период обострения заболевания относительно минимальной активности воспаления, их уровни повышались при нарастании тяжести заболевания (табл. 2). Представленные результаты свидетельствуют о том, что непосредственно в очаге воспаления по мере нарастания активности воспаления отмечается активация Т-лимфоцитов-хелперов (Тh) 1-го и 2-го типа.

Таблица 2. УУровни IL-4 и IFN-γ в мокроте больных МВ (М ± m).

Характерной особенностью хронического воспаления в легких больных МВ является стойкая инфильтрация с массивной нейтрофилией в воздухоносных путях. При исследовании продуктов дегрануляции нейтрофилов у больных МВ в данной работе было выявлено достоверное (p < 0,05) повышение содержание МРО и LF в мокроте в период обострения заболевания относительно минимальной активности воспалительного процесса, причем эта закономерность наблюдалась при среднетяжелом и тяжелом течении заболевания (табл. 3). Была обнаружена сильная положительная линейная корреляция между содержанием МРО и LF в мокроте всех обследованных больных МВ, коэффициент корреляции Пирсона составил r = 0,747, p < 0,001, коэффициент детерминации — r² = 0,559.

Таблица 3. Уровни миелопероксидазы и лактоферрина в мокроте больных МВ (М ± m).

Нейтрофильная эластаза содержится в азурофильных гранулах и при дегрануляции освобождается в межклеточные пространства в бронхолегочной ткани больных. Эта сериновая протеиназа обладает широким спектром субстратной специфичности, способна разрушать эластиновые волокна, все типы коллагенов, протеогликаны и ряд других структур соединительного каркаса легких. В легочной ткани основным ингибитором эластазы нейтрофилов является α1-PI. Определение соотношения активности эластазы и уровня ее основного ингибитора в мокроте больных МВ может косвенно отражать степень выраженности нарушений протеиназо–антипротеиназного баланса в бронхолегочной системе. При изучении активности эластазы в мокроте установлены достоверно (p < 0,05) более высокие значения этого параметра у больных МВ с тяжелым и среднетяжелым течением заболевания в период обострения относительно минимальной активности (табл. 4). Такая же закономерность была выявлена при исследовании уровня α1-PI. Показатели активности эластазы и уровня alpha;1-PI в мокроте больных с тяжелым течением МВ были достоверно (p < 0,05) выше, чем у больных со среднетяжелым течением заболевания (табл. 4).

Таблица 4. Уровни α1-PI и активность эластазы в мокроте больных МВ (М ± m).

Обсуждение результатов

МВ — моногенное заболевание, обусловленное мутацией гена, кодирующего трансмембранный регуляторный белок, который в организме играет роль ионселективного хлоридного канала. Нарушение транспорта ионов хлора через апикальную мембрану эпителиальных клеток приводит к почти полному отсутствию секреции хлоридов эпителием дыхательных путей. Это способствует образованию вязкой мокроты и развитию инфекционного процесса в бронхолегочной системе больных [5]. Заболевание характеризуется поражением зкзокринных желез жизненно важных органов и систем и имеет обычно тяжелое течение и неблагоприятный прогноз [6, 7].

Первичным патофизиологическим последствием дефекта гена МВ является нарушение функции слизистых бронхиальных желез дыхательных путей, ведущее к увеличению продукции вязкого бронхиального секрета. Без сомнения, такие измененные условия не могут не влиять на функциональную активность клеток бронхолегочного эпителия, способного в условиях активации синтезировать и освобождать целый ряд биологически активных веществ, включая IL-6, IL-8 и TNF-α, метаболиты обмена арахидоновой кислоты и ряд др. В культуральных исследованиях установлено, что клетки бронхолегочного эпителия больных МВ в повышенных количествах экспрессируют межклеточные адгезионные молекулы-1 (ICAM-1) и освобождают основной хемоаттрактант для нейтрофилов — IL-8 [8]. Приток в очаг воспаления нейтрофилов сопровождается их активацией, наработкой активных соединений кислорода и дегрануляцией. Эластаза, освобождаемая из азурофильных гранул нейтрофилов, активирует секрецию слизи бокаловидными клетками и синтез провоспалительных цитокинов и хемоаттрактантов эпителиальными клетками, макрофагами, нейтрофилами и другими клетками воспаления. В настоящее время проводится интенсивное изучение роли тучных клеток больных МВ в запуске воспаления, поскольку трансмембранный регуляторный белок МВ (CFTR — cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), представляющий собой цАМФ-зависимый хлоридный канал, присутствует не только в эпителиальных, но также и в тучных клетках больных МВ [9]. В связи с этим тучные клетки, так же как и бронхолегочный эпителий, могут вносить существенный вклад в инициацию раннего воспалительного ответа при МВ, синтезируя и освобождая целый ряд метаболитов обмена арахидоновой кислоты, провоспалительных цитокинов и хемокинов еще до начала присоединения инфекции.

Вслед за этими этапами наступает достаточно раннее развитие инфекционных процессов, вызываемых микроорганизмами, имеющими предрасположенность к колонизации в дыхательных путях — Pseudomonas aeruginosa, Peudomоnas cepacia, Staphylococcus aureus.

Как известно, цитокины в организме выполняют разнообразные функции. Они обеспечивают регуляцию процессов созревания, роста и дифференцировки клеток, развития воспаления и иммунного ответа, запускают процессы репарации поврежденных тканей, координируют в целом работу основных гомеостатических систем организма — иммунной, нервной и гормональной. В культуральных исследованиях, проводимых на эпителиальных линиях клетках бронхолегочного эпителия больных МВ, была показана повышенная экспрессия провоспалительных цитокинов (TNF-α и IL-8) клетками эпителия в ответ на экспозицию Pseudomonas aeruginosa, а также изучены различные механизмы регуляции синтеза провоспалительных цитокинов эпителием бронхов больных МВ — зависимые и независимые от ядерного фактора kB (NF-kB) [10, 11]. При исследовании образцов мокроты больных МВ было обнаружено повышенное содержание провоспалительных IL-1β, IL-8, TNF-α и IFN-γ при обострении заболевания по сравнению с периодом минимальной активности, а также достоверно более высокие уровни определяемых цитокинов при более тяжелом течении заболевания (табл. 1, 2). Полученные результаты согласуются с данными о высоком содержании провоспалительных цитокинов и о низком уровне противовоспалительных цитокинов — IL-10 и рецепторного антагониста IL-1 в мокроте и жидкости бронхоальвеолярного лаважа больных МВ [12].

Таким образом, результаты изучения провоспалительных цитокинов в мокроте больных МВ указывают на возможность использования этих показателей для характеристики активности воспаления и оценки тяжести течения патологического процесса, развивающегося в бронхолегочной системе.

Активация нейтрофилов приводит к выделению секреторных продуктов, участвующих в защите легких от бактериальной инфекции. Вместе с тем в условиях длительного, интенсивного и, в конечном итоге, непродуктивного нейтрофильного воспаления в бронхолегочной системе больных МВ развивается выраженный дисбаланс в протеиназо–антипротеиназных и оксидантно–антиоксидантных системах, что проявляется активацией деструктивных процессов и формированием бронхоэктаз. Хронический дисбаланс в системе нейтрофильная эластаза –антипротеиназы на поверхности респираторного эпителия больных МВ развивается очень рано (уже в возрасте 1 года) и впоследствии приводит к повреждению легочной ткани.

Исследуемые параметры — активность эластазы, уровень ее основного ингибитора в легких — α1-PI, содержание миелопероксидазы и лактоферрина нейтрофилов в мокроте — коррелируют с активностью воспаления и тяжестью течения заболевания (табл. 3, 4). Ранее было показано, что величина этих параметров активации нейтрофилов в бронхолегочной системе больных МВ превышает соответствующие показатели у больных хронической обструктивной болезнью легких [13].

Известно, что такие нейтрофильные белки, как миелопероксидаза и лактоферрин, обеспечивают, с одной стороны, атимикробную защиту, а с другой — повреждают эпителиальные и эндотелиальные клетки ткани легкого [14]. В бронхиальных смывах больных МВ большинство молекул α-ингибитора протеиназ находится в неактивном состоянии — связаны или разрушены, причем в окислительной инактивации антипротеиназ важную роль играют оксиданты, включая гипохлорную кислоту — продукт реакции миелопероксидазы нейтрофилов [15]. С другой стороны, миелопероксидаза способна к окислительной инактивации эластазы и катепсина G, т. е. может участвовать в предотвращении деструкции тканей в очаге воспаления. Таким образом, несмотря на неоднозначность роли продуктов активированных нейтрофилов в патогенезе МВ — микробицидность, с одной стороны, и участие в процессах деструкции тканей организма.хозяина — с другой, определение уровней высокоспецифичных маркеров активации нейтрофилов в жидкости, максимально приближенной к очагу воспаления — в мокроте, позволяет оценить активность воспаления и тяжесть течения заболевания.

Литература

1. Koehler D.R., Downey G.P., Sweezey N.B. et al. Lung inflammation as a therapeutic target in cystic fibrosis. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 2004; 31: 377-C381.
2. Tabary O., Muselet C., Escotte S. et al. Interleukin-10 inhibits elevated chemokine interleukin.8 and regulated on activation normal T cell expressed and secreted production in cystic fibrosis bronchial epithelial cells by targeting the I¦КB kinase ¦Б/¦В complex. Am. J. Pathol. 2003; 162: 293-C302.
3. Levent J., Tarek K., Driss E. et al. Activation of TLR-9 induces IL.8 secretion through peroxynitrite signaling in human neutrophils. J. Immunol. 2006; 176: 1195-C1202.
4. Sadikot R., Han W., Everhart M. et al. Selective I¦КB kinase expression in airway epithelium generates neutrophilic lung inflammation. J. Immunol. 2003; 170: 1091-C1098.
5. Орлов С.Н., Баранова И.А., Чучалин А.Г. Внутриклеточные системы сигнализации и патологии легких. Транспорт ионов в клетках эпителия дыхательных путей. Пульмонология 1999; 1: 77–84.
6. Капранов Н.И. Успехи и проблемы в диагностике и лечении муковисцидоза в России. Пульмонология 2001; 3: 9–16.
7. Гембицкая Т.Е., Желенина Л.А., Фаустова М.Е. и др. Эффективность терапии N.ацетилцистеином (флуимуцил, '' Zambon group'') бронхообструктивного синдрома при муковисцидозе. Пульмонология 2003; 1: 80–83.
8. Aldallal N., MacNaughton E., Manzel L. et al. Inflammatory response in airway epithelial cells isolated from patients with cystic fibrosis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2002; 166: 1248-C1256.
9. Kulka M., Dery R., Nahirney D. et al. Differential regulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by interferon ¦Г in mast cells and epithelial cells. J. Pharmacol. Exp. Ther .2005; 315: 563-C570.
10. Li J., Johnson X., Lazvovskaia S. et al. Signaling intermediates required for NFkB activation and IL.8 expression in CF bronchial epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2003; 284 (2): 307-C315.
11. Ordones C., Henig N., Mayer.Hamblett N. et al. Inflammatory and microbiologic markers in induced sputum after intravenous antibiotics in cystic fibrosis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2003; 168: 1471-C1475.
12. Osika E., Cavaillon J.M., Chadelat K. et al. Distinct sputum cytokine profiles in cystic fibrosis and other chronic inflammatory airway disease. Eur. Respir. J. 1999; 14: 339ЁC346.
13. Пухальский А.Л., Шмарина Г.В. Особенности воспаления при муковисцидозе — мифы и реальность. В кн.: VII Национальный конгресс по муковисцидозу: Сборник статей и тезисов. М.; 2005: 69–71.
14. Кокряков В. Биология антибиотиков животного происхождения. СПб.: Наука; 1999. 162.
15. Shao B., Belaaouaj A., Verlinde C. et al. Metionine Sulfoxide and proteolytic cleavage contribute to the inactivation of cathepsin G by hypochlorous acid. An oxidative mechanism for regulation of serine proteinases by myeloperoxidase. J. Biol. Chem. 2005; 280 (32): 29311-C29321.