В течение 6 лет у больных МВ, наблюдавшихся в научно.клиническом отделе МВ ГУ МГНЦ РАМН, проводили динамическое исследование различных маркеров воспаления, которые сопоставляли между собой, а также с другими показателями, характеризующими тяжесть течения заболевания. Все изучавшиеся маркеры воспаления можно разделить на 2 группы: 1) маркеры, характеризующие течение воспалительного процесса in situ (в дыхательных путях), и 2) маркеры, отражающие системный ответ организма на наличие в легких очага воспаления (табл. 1). Всего были обследованы 128 больных с верифицированным диагнозом МВ. Исследования проводились в динамике: большинство пациентов были обследованы многократно (от 5 до 12 раз). Следует отметить, что столь подробному иммунологическому мониторингу больные не подвергались ни в одном из известных центров МВ в мире. В результате удалось установить ряд закономерностей:

1. Маркеры воспаления коррелируют с остротой воспалительного процесса в легких только у больных с относительно высокими показателями функции внешнего дыхания (ФВД) и без синегнойной инфекции. При этом наибольшее значение имеют такие показатели как активность нейтрофильной эластазы (в мокроте), содержание TNF-α (в мокроте), высота пролиферативного ответа лимфоцитов периферической крови и показатель Δh, указывающий на содержание в периферической крови активированных Т-лимфоцитов [1].
2. В некоторых случаях улучшение функции легких может сопровождаться существенным повышением активности нейтрофильной эластазы в мокроте. Такое повышение имеет, как правило, транзиторный характер и связано с массовой гибелью нейтрофилов в алгинатной пленке (биофильме) в связи с уменьшением продукции провоспалительных цитокинов, являющихся факторами выживания для нейтрофильных лейкоцитов [2].
3. Проводя сравнительное изучение соотношения уровней TNF-α и IL-10 (соответственно про- и противовоспалительных цитокинов) в крови здоровых лиц и больных МВ, было показано, что, хотя больные МВ и способны к достаточно интенсивной продукции IL.10, синтез этого цитокина имеет определенные ограничения. Так, если у здоровых лиц положительная линейная корреляция между этими 2 цитокинами исчезала при стимуляции иммунной системы (введение живой вирусной вакцины) за счет резкого превалирования уровня IL.10, у больных МВ она сохранялась в течение всего срока наблюдения (> 6 мес.), вне зависимости от обострений бронхолегочного процесса [3].
4. Благоприятный эффект длительной терапии больных МВ малыми дозами 14-членного макролидного антибиотика кларитромицина связан не только с противовоспалительным действием этого препарата, но и с его иммуномодулирующей активностью, благодаря которой происходит переключение Th2.типа иммунного ответа на Th1-тип [4].
5. Установлено, что при назначении микросферических энзимов больным МВ, ранее не получавшим адекватной заместительной ферментотерапии, существует опасность развития системного оксидативного стресса. Причина развития которого у таких больных связана с появлением большого количества новых мишеней для перекисного окисления липидов на фоне истощенных антиоксидантных систем организма [5, 6].

Таблица 1. Маркеры воспаления, изучавшиеся у больных МВ.

Таким образом, в результате многолетних исследований в ГУ МГНЦ РАМН была разработана методика иммунологического мониторинга больных МВ. Эффективность такой интегративной оценки состояния больных была подтверждена в ходе клинических испытаний новых методов терапии (нимесулид, кларитромицин) [7–10].

Современные взгляды на механизмы поддержания гомеостаза включают в себя представления о том, что иммунная система высших позвоночных, в т. ч. человека, обеспечивает состояние т. н. "периферической толерантности". Термин "периферическая толерантность", в отличие от понятия "центральная толерантность", когда речь идет об элиминации аутореактивных клонов в тимусе, предусматривает инактивацию потенциально опасных лимфоцитов, направленных против аутоантигенов и аллергенов, в периферическом компартменте иммунной системы. В принципе, такого рода события могут развиваться практически в любой части организма, однако наибольшее значение имеют зоны соприкосновения внутренней среды организма с окружающим пространством. К таким зонам относятся прежде всего слизистая оболочка желудочно-кишечного тракта, эпителий бронхов, слизистые урогенитального тракта, кожа. Несмотря на значительные анатомо-физиологические различия между органами и / или системами органов, существуют универсальные механизмы индукции периферической толерантности. Согласно современным представлениям главную ответственность за поддержание состояния периферической толерантности несет популяция лимфоцитов, получившая название регуляторных Т-клеток (Treg) [11]. В частности, активная супрессия со стороны таких клеток играет ключевую роль в контроле над аутореактивными Т-клетками. Регуляторные Т-клетки, обладающие свойствами клеток-супрессоров, имеют фенотип CD4+CD25+high, экспрессируют как растворимый, так и мембраноассоциированный TGF-β, а также транскрипционный фактор FoxP3 [12]. Клетки Treg способны не только ингибировать Th1 и Th2-лимфоциты, но также тормозят активность В-лимфоцитов, угнетают продукцию провоспалительных цитокинов и нарушают миграцию нейтрофилов в очаг воспаления. Следует иметь в виду, что регуляторные Т.клетки активируются не только в случае стимуляции аутореактивных клонов лимфоцитов, но и являются непременными участниками иммунных реакций на бактериальные и вирусные антигены. При этом их чрезмерная активация приводит к опасной для организма супрессии иммунного ответа, последствиями которой может быть развитие злокачественных новообразований или генерализация инфекционного процесса [13–15].

В последнее время появилось большое количество работ, как экспериментальных, так и выполненных на клиническом материале, посвященных роли клеток Treg в развитии различных видов патологии. Так, несомненная патогенетическая роль дефицита Treg установлена при развитии экспериментальных колитов у грызунов, при бронхиальной астме, ряде ревматических заболеваний, сахарном диабете, рассеянном склерозе, аутоиммунном миокардите [11]. Разработаны методы, позволяющие выявить такой дефицит, как в прямых экспериментах, так и по ряду косвенных признаков.

Есть основания полагать, что у больных МВ имеет место дефицит клеток Treg и как следствие нарушение периферической толерантности. Такое предположение можно сделать на основании клинических данных (чрезмерный воспалительный ответ в легких, частое присоединение цирроза и сахарного диабета), а также результатов лабораторных исследований (табл. 2). Скорее всего такая форма иммунной недостаточности непосредственно связана с первичным генетическим дефектом этих больных. Хорошо известно, что у больных МВ нарушена функция эпителия различных органов. Вполне возможно, что эпителий тимуса не является в этом отношении исключением. Учитывая фундаментальную роль тимического эпителия в процессе созревания Т.клеток, можно предположить, что у больных МВ имеет место частичное нарушение этого процесса, в т. ч. в форме недостаточного образования клеток Treg. Это предположение позволяет предложить альтернативную концепцию генотерапии при МВ. Целью такого вмешательства будет не восстановление нормального генотипа клеток эпителия бронхов, что даже в случае успеха носит не более чем паллиативный характер, а нормализация количества клеток Treg. Схема такого варианта генотерапии выглядит следующим образом (см. рисунок). Аутологичные лимфоциты периферической крови подвергают сортингу с помощью проточного цитофлуорометра с целью получения клеточного пула, содержащего преимущественно лимфоциты с фенотипом CD4+. Такие CD4+-клетки стимулируются моноклональными антителами анти-CD3 и анти.CD28 и культивируются в присутствии IL-2, являющегося обязательным ростовым фактором для клеток Treg. Таким образом, будет получена клеточная культура, обогащенная предшественниками клеток Treg [16]. Следующим этапом является трансфекция гена FOXP3 [17], что должно превратить клетки-предшественники в зрелые клетки Treg, которые могут быть введены обратно больному.

Таблица 2. Лабораторные данные, позволяющие заподозрить дефицит клеток Treg у больных МВ.

Рисунок. Возможная схема генотерапии при МВ (объяснение в тексте).

В рамках этого направления авторы планируют исследовать регуляторные Т-лимфоциты у лиц с предполагаемым снижением их активности, в т. ч. у больных МВ. Заключение об активности регуляторных лимфоцитов будет сделано на основании уровня таких цитокинов как IL.10, TNF-α, IFN-γ, IL-4, TGF-β, а также по интенсивности пролиферативного ответа лимфоцитов в культуре на бактериальные и вирусные антигены. Кроме того, методом проточной цитофлуорометрии в периферической крови больных будет определяться содержание лимфоцитов с фенотипом CD4+CD25+high. Проведение такого рода исследований позволит получить принципиально новые данные о роли иммунной системы в патогенезе МВ и, возможно, предложить новые подходы к терапии этого тяжелого заболевания.

Литература

1. Pukhalsky A.L., Kapranov N.I., Kalashnikova E.A. et al. Inflammatory markers in cystic fibrosis patients with lung Pseudomonas aeruginosa infection. Mediat. Inflamm. 1999; 8: 159–167.
2. Пухальский А.Л., Шабалова Л.А., Шмарина Г.В. и др. Использование нимесулида в лечении больных муковисцидозом. Пульмонология 2001; 3: 46–50.
3. Shmarina G.V., Pukhalsky A.L., Kokarovtseva S.N. et al. Tumor necrosis factor.¦Б / interleukin.10 balance in normal and cystic fibrosis children. Mediat. Inflamm. 2001; 10: 191-C197.
4. Pukhalsky A.L., Shmarina G.V., Kapranov N.I. et al. Anti-inflammatory and immunomodulating effects of clarithromycin in patients with cystic fibrosis lung disease. Mediat. Inflamm. 2004; 13: 111-C117.
5. Каширская Н.Ю., Шмарина Г.В., Капранов Н.И., Пухальский А.Л. Динамика маркеров воспаления крови на фоне антибактериальной терапии у детей, больных муковисцидозом, с различным режимом приема панкреатических ферментов. Гастроэнтерология 2004; 2: 48–52.
6. Shmarina G.V., Pukhalsky A,L., Kokarovtseva S.N. et al. Improvement of nutrient absorption may enhance systemic oxidative stress in cystic fibrosis patients. Mediat. Inflamm. 2001; 10: 61-C67.
7. Певницкий Л.А., Пухальский А.Л., Капранов Н.И. и др. Иммунологический мониторинг больных муковисцидозом. Значение различных лабораторных показателей. Вестн. РАМН 2000; 5: 40–46.
8. Пухальский А.Л., Шмарина Г.В., Капранов Н.И. Маркеры воспаления у больных муковисцидозом. Пульмонология 2002; 5: 39–42.
9. Пухальский А.Л., Шмарина Г.В., Капранов Н.И. и др. Противовоспалительное и иммуномодулирующее действие кларитромицина у больных с легочной формой муковисцидоза. Атмосфера. Пульмонол. и аллергол. 2004; 3: 57–60.
10. Pukhalsky A., Shmarina G., Kashirskaja N. et al. Effet de la clarytromycine sur les parametres fonctionnels respiratoires et sur le sisteme immunitaire d'enfants atteints de mucoviscidose. Pediatre 2001; 36: 14-C18.
11. Kyewski B., Derbrinski J. Self.representation in the thymus: an extended view. Nat. Rev. Immunol. 2004; 4: 688-C698.
12. Chen W., Jin W., Hardegen N. et al. Conversion of peripher. al CD4+ CD25ЁC naive T cells to CD4+ CD25+ regulatory T cells by TGF.¦В induction of transcription factor Foxp3. J. Exp. Med. 2003; 198: 1875-C1886.
13. Kasprowicz D.J., Smallwood P.S., Tyznik A.J, Ziegler S.F. Scurfin (FoxP3) controls T.dependent immune responses in vivo through regulation of CD4+ T cell effector function. J. Immunol. 2003; 171: 1216-C1223.
14. Maloy K.J., Salaun L., Cahill R. et al. CD4+ CD25+ TR cells suppress innate immune pathology through cytokine. dependent mechanisms. J. Exp. Med. 2003; 197: 111ЁC119.
15. Turk M.J., Guevara.Patino J.A., Rizzutto G.A. et al. Concomitant tumor immunity to a poorly immunogenic melanoma is prevented by regulatory T cells. J. Exp. Med. 2004; 200: 771-C782.
16. Caramalho I., Lopes.Caravalho T., Ostler D. et al. Regulatory T cells selectively express Toll.like receptors and are activated by lipopolysaccharide. J. Exp. Med. 2003; 197: 403-C401.
17. Hori S., Nomura T., Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science 2003; 299 (5609): 1057-C1061.