С момента обнаружения гена Cystic Fibrosis Trans membrane Conductance Regulator (CFTR) ведутся поиски соответствия генотипа фенотипу больного. Генетический полиморфизм МВ определяет клиническое разнообразие заболевания, но далеко не всегда обнаруживается четкая корреляция между появлением респираторной патологии и какими-либо мутациями в гене CFTR [3]. И наоборот, не редки пациенты с одинаковыми мутациями CFTR-гена, но с различными проявлениями болезни [4]. Помимо огромного разнообразия мутаций CFTR-гена, их проявление существенно зависит от функции других генов, т. н. генов-модификаторов. В настоящее время рассматривается возможное участие в развитии патологии легких при МВ генов, ответственных за формирование иммунного ответа (в частности, генов интерлейкина-4 (IL-4) и его рецептора), а также генов, кодирующих синтез оксида азота (NO) в организме.

NO является одним из наиболее важных биологических медиаторов, который вовлечен во множество физиологических и патофизиологических процессов. Он представляет собой уникальный по своей природе и механизмам действия вторичный мессенджер в большинстве клеток организма и участвует в реализации многих важных физиологических функций, таких как вазодилатация, нейротрансмиссия, снижение агрегации тромбоцитов, реакции иммунной системы, регуляция тонуса гладких мышц и др. [5]. В организме NO синтезируется клетками из аминокислоты L.аргинин при помощи фермента NO.синтазы (NOS) [6]. Идентифициpованы 3 изофоpмы NOS каждая из котоpыx кодиpуетcя cобcтвенным геном [6]. Функционально выделяют конcтитутивные и индуцибельные NOS. К конcтитутивным формам относятся эндотелиальная NOS (eNOS, или тип 3) и нейpональная NOS (nNOS, или тип 1), iNOS, или тип 2, является индуцибельной. Изофоpмы NOS отличаютcя дpуг от дpуга кодиpующим геном, pаcпpеделением в клеткаx, cпоcобом регуляции, cкоpоcтью ответа на стимул. В легких человека NOS локализованы в эндотелии сосудов бронхов, эпителиальных клетках, нервах бронхиальной стенки.

Ген NOS1 локализован в 12-й хромосоме (12q24) [7]. Полиморфизм гена NOS1 представляет собой различное количество повторов AAT в 20-м интроне. Согласно некоторым данным количество таких повторов > 12 и ассоциировано с увеличением концентрации NO в выдыхаемом воздухе [8]. Ген eNOS локализован в 7q36 и состоит из 26 экзонов. Полиморфизм в интроне 4 представлен 2 аллелями: "b", в котором имеются 5 повторяющихся фрагментов 27 п. н., и "а", в котором только 4 таких повтора. В европейской белой популяции более распространенным является аллель b. В исследовании здоровых людей было показано, что а/а-генотипу соответствует максимальный уровень базального NO, у людей с b/b-генотипом уровень NO приблизительно в 2 раза ниже [9].

В качестве одних из возможных генов-кандидатов, влияющих на тяжесть течения МВ, рассматриваются гены, кодирующие синтез цитокина IL-4 и α-цепи рецептора IL.4. Цитокины являются медиаторами межклеточных коммуникаций при иммунном ответе, гемопоэзе и развитии воспаления, эффекторами некоторых реакций иммунитета и служат связующим звеном между иммунной и другими системами организма [10]. Цитокины взаимосвязаны и образуют систему взаимодействующих элементов — цитокиновую сеть.

IL.4 — гликопротеин, продуцируемый Т-хелперами 2-го класса (Th2), а также тучными клетками. Основными клетками.мишенями IL-4 служат В-лимфоциты, для которых он является самым сильным ростовым фактором. Известно, что IL-4 усиливает выработку IgE и IgG1, вызывая переключение С-генов иммуноглобулинов, повышает экспрессию и секрецию CD23 на В-лимфоцитах и тучных клетках — низкоаффинного рецептора для IgE, который потенцирует выработку IgE. Эти эффекты, а также способность IL-4 поддерживать пролиферацию серозных тучных клеток имеют прямое отношение к развитию аллергических реакций и воспаления дыхательных путей.

Ген IL-4 картирован в 5-й хромосоме (5q31.1). Функционально значимым полиморфным вариантом гена IL-4 является полиморфизм C590T в промоторной области, который представляет собой замену C на T в 590-м положении. Согласно некоторым исследованиям [11] полиморфизм С590Т гена IL-4 ассоциирован с повышенной промоторной активностью гена и повышенным уровнем общего IgE в сыворотке крови. Ген α-цепи рецептора IL-4 (IL-4Rα) картирован в 16-й хромосоме (16р12). Полиморфизм Q576R представляет собой замену глутамина (Q) на аргинин (R) в 576-м положении аминокислотной последовательности α-цепи рецептора для IL-4. При этом происходит замена A/G в положении 1902 кДНК-последовательности гена. На основе проведенных экспериментов был сделан вывод, что аллель 576R предрасполагает к развитию аллергии путем изменения сигнальной функции рецептора [12].

Цель работы — изучить особенности аллельного полиморфизма генов, кодирующих синтез конcтитутивных изоформ фермента NOS, IL-4, его рецептора и оценить их возможное влияние на тяжесть течения МВ.

Для выполнения поставленной цели были сформированы основная и контрольная группы. 1-ю группу составили 37 больных МВ в возрасте от 5 до 24 лет, из них — 20 мужчин и 17 женщин. В контрольную группу включены 69 здоровых доноров, жителей Санкт-Петербурга и Северо.Западного региона РФ в возрасте от 17 до 35 лет, без аллергических и хронических заболеваний органов дыхания в анамнезе. Средний возраст обследованных больных составил 13,92 ± 3,77 лет. У обследованных пациентов преобладали тяжелые формы МВ (n = 21), у меньшего числа больных отмечено среднетяжелое течение заболевания (n = 16). Интересно отметить, что в группе больных со средней тяжестью течения заболевания преобладали мужчины (68,75 %), а в группе с тяжелым течением заболевания — женщины (57,14 %). Среди общей группы больных мажорная мутация delF508 в гомозиготном или компаундном состоянии определялась в 86,5 % случаев. Диагноз МВ был установлен на основании комплексного обследования, включавшего в себя данные анамнеза, общеклинические, лабораторные методы, исследование функции внешнего дыхания (ФВД), иммунологическое исследование, а также исследование хлоридов потовой жидкости, разности назальных потенциалов, микробиологическое и рентгенографическое исследование, специальные генетические методы.

Работа выполнялась на образцах ДНК, выделенных из лимфоцитов периферической крови. Полиморфные варианты генов IL.4 (С590Т), IL-4Rα (Q576R) исследовались методом ПДРФ-анализа (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов). Количество тринуклеотидных AAT-повторов в 20-м интроне NOS1 гена и повторов по 27 п. н. в 4-м интроне eNOS гена исследовали методом полимеразной цепной реакций (ПЦР).

Определение достоверности различий между сравниваемыми группами или подгруппами по частотам генотипов и аллелей производили с помощью критерия χ² по стандартной формуле с учетом поправки Йетса для парных сравнений и поправки Бонферрони для множественных сравнений с контрольной группой. В случае выявления достоверных отличий между контролем и исследуемой группой, вычисляли коэффициент соотношения шансов (odds ratio — OR). Значение OR, применительно к нашим данным, показывает, во сколько раз вероятность наличия данного генотипа у больных превышает вероятность его наличия в контрольной группе, или же, во сколько раз выше вероятность иметь то или иное заболевание, обладая определенным генотипом.

Результаты

Исследование ФВД является важным диагностическим критерием тяжести бронхообструктивного синдрома у больных МВ. При исследовании ФВД среднее значение жизненной емкости легких (ЖЕЛ) в группе больных МВ соответствовало легким нарушениям ЖЕЛ (72,88 ± 7,62 % от N). При этом нормальные значения ЖЕЛ отмечались лишь у 9 больных МВ (24,3 %). Среднее значение объема форсированного выдоха за 1-ю с (ОФВ₁) в группе больных МВ соответствовало умеренным нарушениям бронхиальной проходимости (66,31 ± 8,1 % от N). Нормальные показатели ОФВ₁ отмечались у 12 (32,4 %) больных МВ. Исследование проводилось в период ремиссии заболевания.

Согласно нашей гипотезе о влиянии полиморфизма ряда генетических систем, определяющих фенотипические особенности МВ, мы изучили частоты генотипов и аллелей гена IL-4 в группе больных МВ и контрольной группе здоровых доноров. Группы больных МВ (в зависимости от степени тяжести) и контрольная группа по частотам генотипов и аллелей гена IL.4 статистически не отличались друг от друга. При анализе частот аллелей гена IL-4 в группе больных МВ отмечено, что среди женщин частота Т-аллеля (m) составляет 29,4 %, что достоверно выше, чем у мужчин (10,0 %) (χ² = 4,51, р < 0,05) (таблица). При анализе распределения генотипов по гену IL-4 было выявлено, что гомозиготы по Т-аллелю встречаются только в группе больных женского пола (17,6 %), среди мужчин данный генотип не встречался (χ² = 3,84, р < 0,05) (рис. 1). Полученные данные указывают на большое значение аллергического компонента воспаления дыхательных путей и, возможно, связаны с более тяжелым течением МВ и более низкой продолжительностью жизни у женщин. При анализе частот аллелей и генотипов гена IL-4Rα, не было выявлено четкой зависимости между полиморфными вариантами гена α-цепи рецептора IL-4 и особенностями клинической картины при МВ.

Таблица. КЧастоты аллелей гена IL-4 в группе больных МВ в зависимости от пола пациентов.

Рисунок 1. Частоты генотипов по гену IL-4 в группе больных МВ в зависимости от пола пациентов.

Частоты аллелей генов NOS1 и eNOS в группе больных МВ в целом, а также в подгруппах среднетяжелого и тяжелого течения, не отличались от контрольной группы. Однако при оценке сочетаний полиморфных вариантов 2 генов NOS1 и eNOS выявлено, что комбинация генотипов NOS1 гена ≥12/≥12 и eNOS гена 4b/4b (сочетанный генотип NOS1 и eNOS генов, приводящий к наименьшей выработке базального NO) встречалась в 21,6 % в группе больных МВ и всего в 8,7 % — в контрольной группе (рис. 2). В группе больных МВ с хронической синегнойной инфекцией данная комбинация зарегистрирована в 25 % случаев, в то время как в группе без колонизации Ps. aeruginosa — лишь в 11 % случаев.

Рисунок 2. Анализ сочетанного генотипа генов NOS1 и eNOS, приводящий к наименьшей выработке базального NO.

Отмечена прямая корреляция между комбинацией полиморфных вариантов генов NOS1 ≥12/≥12 и eNOS 4b/4b и колонизацией дыхательных путей Ps. aeruginosa. Учитывая способность NO оказывать влияние на иммунную систему и воспалительный ответ, участвовать в реализации важнейших физиологических и патофизиологических реакций организма, можно предположить, что выработка NO является одним из механизмов местной защиты легких. Поэтому при снижении выработки NO и сниженном его содержании в выдыхаемом воздухе создаются более благоприятные условия для колонизации Ps. aeruginosa. Обнаруженная нами частая комбинация полиморфных вариантов генов NOS1 ≥12/≥12 и eNOS 4b/4b в группе больных МВ, особенно в подгруппе с тяжелым течением, не только объясняет патогенетические механизмы колонизации Ps. aeruginosa и дальнейшего прогрессирования патологического процесса, но и определяет перспективы возможного лечения таких больных с помощью ингаляций NO с учетом генетической характеристики каждого пациента.

Таким образом, изученные полиморфные варианты генов вносят существенный вклад в фенотипические проявления легочных поражений при МВ, объясняя, в частности, частое поражение бронхолегочной системы у этих больных синегнойной палочкой и быстрое формирование хронического синегнойного процесса. Выявленные нами особенности генотипа и фенотипа больных МВ крайне важны для прогнозирования течения заболевания, первичной и вторичной профилактики МВ, открывают перспективы для разработки новых методов лечения, например ингаляциями NO.

Литература

1. Капранов Н.И., Каширская Н.Ю., Петрова Н.В. Муковисцидоз. Достижения и проблемы на современном этапе. Клин. генетика 2004; 9: 398–412.
2. Гембицкая Т.Е. Наследственно детерминированные заболевания легких. В кн.: Палеева Н.Р. (ред.) Болезни органов дыхания. М.: Медицина; 2000. 561–573.
3. Cutting G.R. Genotype defect: its effect on cellular function and phenotypic expression. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1994; 15: 356–363.
4. Boat T.F. Phenotypic diagnosis of CF / Symposium Session Summaries. Pediatr. Pulmonol. 1994; 10: 135.
5. Lowenstein C.J., Dinerman J.L., Snyder S.H. Nitric oxide: a physiologic messenger. Ann. Intern. Med. 1994; 120: 227–237.
6. Nathan C., Xie Q. Nitric oxide synthases: roles, tolls and controls. Cell 1994; 79: 915–918.
7. Hall A.V., Antoniou H., Wang Y. et al. Structural organization of the human neuronal nitric oxide synthase gene (NOS1). J. Biol. Chem. 1994; 269: 33082–33090.
8. Wechsler M.E., Grasemann H., Deykin A. et al. Exhaled nitric oxide in patients with asthma association with NOS1 genotype. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000; 162: 2043–2047.
9. Wang X.L., Mahaney M.C., Siew A. Genetic contribution of the endothelial constitutive nitric oxide synthase gene to plasma nitric oxide levels. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1997; 17: 3147–3153.
10. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Медицина; 1999.
11. Rosenwasser L.J., Klemm D.J., Dresback J.K. et al. Promoter polymorphisms in the chromosome 5 gene cluster in asthma and atopy. Clin. Exp. Allergy 1995; 2: 74–78, 95–96.
12. Hershey G.K., Friedrich M.F., Esswein L.A. et al. The association of atopy with a gain.of.function mutation in the alpha subunit of the interleukin.4 receptor. N. Engl. J. Med. 1997; 337: 1720–1725.